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Cell Counting Kit-8 常见问题汇总解答

作者:zhenzi          点击量:0         更新时间:2021/10/21 11:29:53


Cell Counting Kit-8

海点创生物 

Cell Counting Kit-8 特惠活动推出后,咨询下单的客户络绎不绝,针对大家最常咨询的问题,今天就用一篇文章来为大家一一解答。

了解更多Cell Counting Kit-8详情可关注微信公众号,查看往期文章。

文末抢购入口限时开放。




常见问题汇总

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Q1

96孔板操作实例外,24孔板,12孔板

如何检测?

与培养基1:10的比例加入。

Q2

如何测定空白孔?

空白读值的来源有两部分,还原性物质与细胞本身活性。请确认以下细节。

·还原性物质:可在正式实验之前,在培养基中加入CCK-8和待测药物。如果变色,证明药物有还原性。正式实验检测时,请在加入CCK-8前更换培养基。

·细胞活性变化:CCK-8检测细胞活性,因此细胞活性变化,即使细胞数量不变,空白也会变化。因此需要确认细胞活性是否存在变化。

Q3

如何终止反应?

有一下几种方法(96孔板):

1、 在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。

2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。

3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。

注意:反应停止后,应在24小时之内测定。

Q4

我可以使用450 nm以外的滤光片吗?

可使用430-490nm的滤光片,450nm滤光片最优。WST-8甲臜染料吸收光谱:

Q5

CCK-8运输与保存条件?

试剂在4℃下可稳定保存24个月。如需长期存放可保存-20℃,但不要反复冻融。如更换其他容器,请先进行稳定性实验,确认试剂稳定性。

Q6

一个孔中应接种多少个细胞?

当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

Q7

能否用384孔板进行试验?

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液,如果加入的CCK-8体积太少,可以先将CCK-8溶液稀释1倍,然后加入培养基体积20%的量

Q8

能否用24孔板进行试验?

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。

Q9

酚红会影响检测吗?

不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

Q10

CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关

性?

有。然而,请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。

Q11

CCK-8能否检测细菌细胞?

可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液,并培养1-4个小时或过夜。但是更推荐使用我公司货号M439的:细菌活性检测试剂盒。

Q12

如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或

孔壁上的残留所带来的误差?

可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

Q13

CCK-8是什么颜色?

应该是粉红色。若颜色不一样,有可能会影响测定。

Q14

CCK-8能否对活细胞进行染色?

不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST®-8),并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST®-8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的,因此CCK-8不能对细胞进行染色。

Q15

CCK-8检测溶液对细胞是否有毒?

CCK-8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是,加到培养基中的CCK-8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。因此,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。

Q16

在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?

有时会有影响。如果药物具有还原性,会和CCK-8发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。

Q17

每次测定的数值不一样,是什么原因?

如何解决?

可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。 一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK-8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

Q18

如何设定空白对照?

在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。

Q19

哪些物质会影响CCK-8的测定?

当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定,例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。

Q20

在实验中吸光度值太高,如果不能减少

细胞数量,如何解决?

可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如:可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

Q21

设定参比波长的目的是什么?必须设定

吗?

不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

Q22

说明书上仅写了96孔板的测定方法,

如果使用24孔板货12孔板,应该加

多少量的CCK-8试剂?

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。

Q23

必须预培养细胞吗?

不一定。如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

Q24

如果加入的药物中含有金属,是否

会有影响?

金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话,将会100%抑制。

Q25

预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?

一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

Q26

CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否

一样?

不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

Q27

悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?

悬浮细胞由于显色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞显色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。

Q28

应该每次做标准曲线吗?

建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。

Q29

有时在药物作用情况下,细胞已经

死亡,但是脱氢酶的活性还在,

是否能计算细胞数量?

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量